急性冠脉综合征患者外周血单核细胞miR—145与超敏C反应蛋白的相关性研究
姜春玲
[摘要]目的探讨急性冠脉综合征（ACS）患者外周血单核细胞（PBMCs）miR-145与超敏C反应蛋白的相关性。方法选取急性冠脉综合征患者90例，其中不稳定型心绞痛（UAP）30例（A组），ST段抬高型心肌梗死（STEMl）30例（B组）和非ST段抬高型心肌梗死（NSTEMl）30例（C组）。另外30例以心前区不适住院，既往无高血压、糖尿病和冠心病史，经心电图、心肌酶学和冠状动脉造影排除冠心病者作为对照组（D组）。采用Rcal-time PCR法检测PBMCs中miR-145表达水平，使用U6作为内参对照。采用ELISA法检测超敏C反应蛋白（hs-CRP）水平。结果A组、B组、C组分别与D组比较，ACS患者外周血单核细胞miR-145表达水平明显降低，均有统计学意义（P<0.05）；A组、B组、C组分别与D组比较，PBMCs培养基上清中细胞因子hs-CRP水平明显升高，均有统计学意义（P< 0.05）；Pcarson相关分析结果显示，ACS患者外周血单核细胞miR-145表达与hs-CRP水平呈负相关性（r=-0.84，P<0.05）。结论ACS患者外周血单核细胞miR-145与超敏C反应蛋白之间呈负相关性，可能成为ACS新型标志物。
[关键词]急性冠脉综合征；外周血单核细胞miR-145；超敏C反应蛋白
中图分类号：l541.4 文献标识码：A 文章编号：1009-816X（2015）05-0359-03
急性冠脉综合征（Axute coronary svndrom，ACS）作为常见的心脏急症，是心血管疾病中致死致残的主要原因，包括不稳定心绞痛（Unstable Angina Pectoris，UAP）和急性心肌梗死（Acute Myocardial Infarction，AMI），而AMI包括非ST段抬高型心肌梗死（Non-ST-Elevation MvocaHlial Infarction，NSTEMI）、ST段抬高型心肌梗死（ST-Elevation Myocardial Infarction，SIEMI）。文献报道，m1R-145在正常动脉血管和已分化的血管平滑肌（VSMCs）中表达最丰富，但在球囊损伤血管、ACS及去分化的VSMCs中表达很低。miR-145是VSMCs的表型调节器，通过对VSMCs的调节而成为ACS的保护因子，但在ACS中的表达情况目前尚不明确。本文对ACS患者血浆miR-145变化及其与hs-CRP的相关性进行探讨。
1.资料与方法
1.1.临床资料：选取2011年3月至2014年3月本院住院确诊为ACS患者90例，UAP、AMI诊断均按美国心脏病学会/美国心脏协会（2009年）标准，且均经冠状动脉造影证实。其中30例UAP（A组），60例AMI分为30例SIEMI（B组）和30例NSTEMI（C组）。另外30例以心前区不适住院，既往无高血压、糖尿病和冠心病史，经心电图、心肌酶学和冠状动脉造影排除冠心病者作为对照组（D组）。本研究经伦理委员会批准，所有患者均自愿加入并签署知情同意书。
1.2.方法：患者均在发病6h内从静脉采取空腹血3ml，肝素钠抗凝。PBMCs采用人外周血淋巴细胞分离液密度梯度离心法进行分离：①置于EDTA—N0抗凝管，将新鲜血液转移至15ml离心管中，加入无菌的5mlPBS等倍稀释血液，上下颠倒混勾。②避光吸取5ml淋巴细胞分离液置于另一l5ml离心管，用吸管吸取稀释的血液，沿管壁小心缓慢加于淋巴细胞分离液上方，形成清晰界面。放入平衡离心机，室温下，2000转/min，离心30min。③离心后可以观察到管内液体分为三层，上层为淡黄色的血浆和PBS，下层主要是红细胞层，层为分离液层，上中层界面一层白色絮状物质即为单个核细胞层或白膜层。④用吸管小心吸取白膜层，置于另一l5ml离心管中，加入2～3倍体积的无菌PBS，上下颠倒混匀，2000转/min，离心10min。⑤倒掉上清，同法沉淀洗涤两次。⑥将⑤所得单个核细胞用900μL Trizol重悬，吸取置于无酶无菌1.5ml EP管中，暂时冻存于-80℃冰箱中以备提取RNA。
采用Real—time PCR法（ABI9700型PCR扩增仪由美国ABI公司：荧光定量PCR仪由德国Eppendorf公司：hsa-miR-145 real—time及RT—PCR引物由广州锐博生物科技有限公司：U6 real—time及RT—PCR引物由广州锐博生物科技有限公司提供）检测PBMCs中miR-145表达水平，使用U6作为内参对照。分离的PBMCs用含10%小牛血清的RPMI1640调整细胞浓度2×106/ml，加入植物血凝素（PHA）5ng/ml浓度，置于37℃，5%C02培养箱培养48h后，收集上清液储存于-20℃用于hs-CRP检测。采用ELISA法（美国Beckman公司的IM-MAG全自动特种蛋白分析系统）检测hs-CRP水平，试剂盒由Beckman公司提供，严格按照试剂盒的说明操作。
2.结果
2.1.一般临床资料比较：A组、B组、C组分别与D组比较，在年龄、性别、体质指数（BMI）、舒张压（SBP）、收缩压（DBP）、空腹血糖（FPG）等构成上无统计学意义（P>0.05）；A组、B组、C组分别与D组比较，ACS患者总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）明显升高，高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）明显降低，均有统计学意义（P<0.05）。
2.2.四组m1R-145相对表达水平：A组、B组、C组分别与D组比较，ACS患者外周血单核细胞miR-145相对表达水平明显降低，均有统计学意义（P<0.05）。且A组、B组、C组之间无统计学差异（P>0.05）。采用ELISA法检测hs-CRP水平，PBMCs培养基上清中细胞因子检测结果表明，A组、B组、C组分别与D组比较，PBMCs培乔基上清中细胞因子hs-CRP水平明显升高，均有统计学意义（P<0.05），且A组、B组、C组之间无统计学差异（P>0.05），见表1。
2.3.ACS患者外周血单核细胞miR-145与hs-CRP的相关性：Pearsom相关分析结果显示，ACS患者外周血单核细胞miR-145相对表达水平与hs-CRP水平呈负相关性（r=-0.84，P<0.05）。
3.讨论
ACS在我国发病率日益上升，是临床上常见的急危重症。ACS发生早期患者主要表现为胸痛症状，如果能在心肌尚未坏死的可逆阶段及时诊断并采取相应的治疗措施，可以大大降低死亡率和致残率。目前，肌钙蛋白（cTnT或cTnl）和肌酸激酶MB同工酶（CK-MB）是诊断ACS特异性和敏感性较高的标志物，但在症状出现6h内灵敏度不高，而且难以检测微小型AMI，早期诊断能力受到限制，筛选新的心肌损伤标志物用于ACS诊断具有重要临床意义。
miRNA是一种单链非编码RNA，包含19-25个核苷酸，通过与靶基因mRNA的3，非编码区特异性结合，促进靶基因降解或抑制转录，进而调控靶基因的表达，在机体细胞的分化、增殖、凋亡等生理病理过程发挥重要作用。miRNA广泛存在于动植物体内，在人类血液、唾液、尿液等体液中均有分布，目前主要作为恶性肿瘤、肌肉损伤、炎症反应等情况的生物标志物。miR-145由23个核苷酸组成，定位于人类染色体Sq32上，在VSMCs高度表达，参与VSMCs收缩表型的维持与正常增殖而成为动脉粥样硬化的保护因子，但其在心血管事件中的变化情况目前尚未权威数据。
本研究中ACS患者miR145表达水平低于正常对照组，与Fichtlscherer的研究结果一致，Fichtlscherer认为miR-145主要作用是调节细胞骨架组件和PBMCs的迁移活性，参与血管内膜修复，因此ACS后miR-145的水平下降可能是斑块破裂和血管损伤的结果。而宋翠珠则发现急性期脑梗死患者血浆miR-145的表达水平升高，推测可能是脑梗死患者使用的阿司匹林、氯吡格雷等抗血小板药物逆转了不稳定斑块炎症反应时相，miR-145上升或是动脉粥样硬化斑块破裂急性期炎症控制的间接表现。巨噬细胞浸润可引起斑块破裂部位出现明显的炎性反应，升高的hs-CRP正是反映了这些巨噬细胞的活性，本研究采血前未给予相应的临床治疗，miR-145降低和hs-CRP升高均表明机体处于不稳定斑块导致的炎症高峰期，但miR-145具体释放和影响机制目前尚不明确，而miR-145可能作为ACS生物标志物的假设，仍需要大量的基础和临床研究。
综上所述，ACS患者血浆miR-145表达明显下降，与炎症反应水平呈负相关，可能作为ACS的一个新型生物标志物。