我国高血压病的流行与控制状况研究进展
王增武
[摘要]目的观察β3整合素在脓毒症大鼠心肌组织中的表达，探讨其在脓毒症心肌损伤中的作用。方法采用腹腔注射大肠杆菌内毒素（LPS）制作脓毒症模型，在相对应的时间点采用左心室插管术测量心功能参数，留取心脏组织分别用免疫印迹（Western Blot）、免疫组化（IHC）检测β3整合素的表达以及HE染色、天狼猩红染色观察心肌组织形态学变化。结果心功能参数的改变主要发生在脓毒症早期，即左心室舒张压、左心室发展压、左心室压力上升的最大变化速率、左心室压力下降的最大变化速率、心肌耗氧指数与对照组相比较，差异有统计学意义（P<005），组织形态学观察实验组大鼠心肌组织细胞空泡变性，排列松散，结构紊乱，间质胶原纤维数量减少。Western Blot和IHC结果显示实验组β3整合素与对照组比较降低，且6h后较显著，差异有统计学意义（P<001）。结论在脓毒症心肌损伤的过程中，β3整合素表达改变显著，其可能参与了脓毒症心肌损伤的机制。
[关键词]脓毒症；心肌损伤；β3整合素
中图分类号：R631文献标识码：A文章编号：1009_816X（2015）04_0274_04
doi：103969/jissn1009_816x20150403Study of the Effects of β3 Integrin in Sepsis Induced Myocardial Injury in Rats. LU Yun_yan， YAN Jing. First People's Hospital of Xiaoshan， Zhejiang 311200， China
[Abstract] Objective To investigate the dynamic changes of changes of expression changes of expressionβ3 integrin in septic rat hearts and its roles in sepsis induced myocardial injury. Methods Sprague_Dawle rats in experimental group were injected Escherichia coli endotoxin （LPS）. At the corresponding time of points， the hearts were isolated for morphologic pathology and sirius red staining， and cardiac functions， including left ventricular developed pressure （LVDP）， left ventricular pressure maximal rate of rise （+dP/dtmax）， left ventricular pressure the maximum rate of descent （-dP/dtmax）， myocardial oxygen consumption index （SPTI*HR） and left ventricular end diastolic pressure （LVEDP） were measured using left ventricular catheterization. The expression of β3 integrin in myocardium were measured using western blotting and immunohistochemistry. Results Hemodynamic changes occurred in the early stage of sepsis. LVDP， +dP/dtmax， -dP/dtmax， SPTI*HR in experimental group decreased significantly， compared with those in control group （P<0.05）. Histopathology of the hearts in LPS group showed vacuolar degeneration， arrangement in loose， structural disorder， interstitial collagen fibers decreased. Western Blot and IHC showed that β3 integrin expression decreased in experimental group， especially 6h after LPS injection（P<0.01）. Conclusions There were significant structural and functional changes in sepsis_induced myocardial injury and β3 integrin involved in the mechanisms of myocardial injury in sepsis rats.
[Key words] Sepsis； Myocardial injury； Beta3 integrin
脓毒症（Sepsis）是目前ICU中的首要死亡原因。40%～50%脓毒症患者合并心功能不全，研究表明脓毒症患者伴心功能不全死亡率（70%）与不伴心功能不全（20%）比较明显升高[1]。整合素是由α和β亚基通过非共价键组成的异二聚体，广泛分布于细胞表面，是细胞表面一类重要的兼具粘附和信号传导功能的受体[2]。其参与了正常心脏发育和某些心脏疾病如心肌肥厚、扩张性心肌病和心肌梗死等的发生过程[3]，但其是否参与脓毒症心肌损伤的机制尚不清楚。本研究观察脓毒症大鼠心肌组织β3整合素表达与脓毒症大鼠心功能参数的变化，探讨脓毒症导致心肌损伤的相关机制。
1材料与方法
11实验动物：选用8至10周、清洁级、雄性SD大鼠90只，体重200～250g，由浙江中医药大学动物实验中心提供（2011年10月）。室温饲养，自由饮食，适应性饲养1周后开始实验。按照随机分配原则分成9组。（1）实验组（LPS组）：采用腹腔注射大肠杆菌内毒素（LPS）5mg/kg制作脓毒症模型，其中实验组按LPS作用时间分成8个亚组：1小时组（LPS 1h），2小时组（LPS 2h），4小时组（LPS 4h），6小时组（LPS 6h），12小时组（LPS 12h），18小时组（LPS 18h），24小时组（LPS 24h），48小时组（LPS 48h），各组均为10只。（2）对照组（NS组）：腹腔注射09%氯化钠注射液（5ml/kg），共10只。
12实验方法：
121心功能参数测定：采用改良的左心室插管术[4]检测大鼠心功能参数。实验组和对照组大鼠以腹腔注射10%乌拉坦（10ml/kg）麻醉并固定，颈部正中切口，分离出右颈总动脉，动脉导管沿右颈总动脉在压力波形的指导下插入左心室，测量左心室舒张压（LVEDP）、左心室发展压（LVDP）、左心室压力上升的最大变化速率（+dP/dtmax）、左心室压力下降的最大变化速率（-dP/dtmax）、心肌耗氧指数（SPTI*HR）等指标。采用上海奥尔科特生物科技有限公司MPA心功能分析系统记录和分析。
122心脏样本采集：所有大鼠在心功能监测完毕后，常规消毒，腹正中切开，钝性分离，摘取心脏，取小部分新鲜的心肌组织置于液氮中保存用于Western Blot测定，余下的置于10%甲醛溶液中固定做HE染色及免疫组织化学（IHC）检测。
123HE染色：光镜观察大鼠心肌组织的病理形态。各组心肌组织块置入10%甲醛固定，石蜡包埋后切片，苏木素染色、封片。
124苦味酸天狼猩红染色：切片脱蜡、蒸馏水洗、苦味酸天狼红染液染30～60min、无水酒精直接分化与脱水、二甲苯透明，封片。
125免疫印迹（Western Blot）检测心肌组织中β3整合素：用液氮研磨新鲜的大鼠心肌组织，加入裂解液，在冰上孵育半小时后4℃离心机后提取上清液为蛋白液，采用BCA法测定蛋白水平。根据样品水平，吸取20ug蛋白上样（稀释成20ul），用6%SDS_PACE（SDS变性不连续聚丙烯酰胺）凝胶电泳，取出凝胶进行湿转膜（100V 15h），把蛋白质转移到PVDF（聚偏二氟乙烯膜）膜上，经过封闭、清洗，加一抗（1：1500）4℃过夜孵育，冲洗，辣根过氧化物酶标记二抗孵育，用化学发光仪显影。
126免疫组化（IHC）检测心肌组织中β3整合素：将石蜡脱水化和抗原热修复，磷酸盐缓冲液（PBS）清洗后，一抗4℃过夜孵育，冲洗，辣根过氧化物酶标记二抗孵育（37℃，05h），以二氨基联苯胺（DAB）显色、苏木素衬染，然后常规脱水、透明、封片、镜检观察结果，呈棕黄色者判为阳性。
13统计学处理：采用SPSS170统计学软件处理，数据结果以（x-±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，各组间两两比较采用t检验，P<005为差异有统计学意义。
2结果
21心功能变化：实验组与对照组比较，实验组大鼠的LVDP、+dP/dtmax、-dP/dtmax、SPTI*HR较对照组（NS组）显著降低，其中1h、2h、4h、6h下降明显；而LVEDP则明显升高，差异有统计学意义（P<005），见表1。表1心功能参数变化（x-±s）
组别（n=10）LVDP（mmHg）LVEDP（mmHg）+dP/dtmax（mmHg/s）-dP/dtmax（mmHg/s）SPTI*HR（mmHg*s*bpm）对照组NS16184±2803-1541±382615848±45133-567138±70265402537±49964实验组LPS_1h11707±1392*-231±539*418442±34945*-361402±46023*313105±25610*LPS_2h11273±1115*-061±165*396177±34445*-330171±42415*270522±93201*LPS_4h12448±1578*-2019±622516089±43715*-456751±120371232879±55680*LPS_6h12832±1826*-1465±662518572±33696*-509908±73444290733±43647*LPS_12h17019±2031-2037±318654288±26910〖〗-610782±71625364788±15801LPS_18h17689±508-1931±090721011±15247*-627860±23558252362±39016*LPS_24h15822±3537-1367±360619572±23410〖〗-613823±11855307237±57040*LPS_48h14405±2930-981±324565045±23410-493864±116074399480±73360P<001<001<001<001<001F5542004595369573注：与对照组比较P<00522光镜下观察大鼠心肌组织形态学变化：
221HE染色观察心肌组织病理形态学的变化：对照组大鼠心肌组织光镜下可见心肌细胞为短柱状的肌纤维，胞核较粗大，肌纤维呈束状分布；间质纤维细胞呈梭形，分布在心肌束的外缘或突向心肌间质，胞核细长。实验组，LPS 6h时未见明显的形态变化，偶见轻度水肿及炎症细胞浸润，LPS 12h后可见心肌细胞肿胀、灶性心肌纤维断裂，心肌细胞可见空泡变性、心肌细胞排列松散，结构紊乱，见图1。图1大鼠心肌组织病理学观察（HE，×400）
222苦味酸天狼猩红染色观察心肌间质纤维组织的变化：对照组大鼠心肌组织经苦味酸天狼猩红染色，普通光镜下心肌肌纤维呈淡黄色，心肌间质的胶原纤维呈猩红色。对照组心肌组织光镜下可见猩红色胶原纤维包围在心肌实质细胞周围排列较整齐。实验组猩红色胶原纤维与对照组相比排列紊乱，其胶原纤维在心肌实质细胞周围的数量明显减少，见图2。图2大鼠心肌组织病理学观察（天狼猩红染色，×200）
23β3整合素在脓毒症大鼠心肌组织中的表达变化：
231Western Blot检测β3整合素蛋白表达：β3整合素实验组与对照组比较蛋白条带颜色变淡，说明其表达降低（实验中均以β_actin为内参作为对照），且在LPS 6h、LPS 12h、LPS 18h、LPS 24h、LPS 48h实验组条带颜色明显变淡，说明其表达显著下降，见图3。
图3Western Blot检测大鼠心肌组织β3整合素蛋白条带
232免疫组化检测大鼠心肌组织中β3整合素表达：以对照组（NS组）加PBS做阴性对照（NS_PBS），观察结果：β3整合素的表达主要在心肌实质细胞，与阴性对照相比其阳性表现是细胞胞浆染色呈均质淡棕黄色。实验组与对照组相比较其胞浆棕黄色颜色明显变浅，说明在β3整合素在脓毒症大鼠心肌组织中的表达降低，见图4。图4大鼠心肌组织β3整合素表达（×200）3讨论
本研究应用大鼠腹腔注射LPS的方法制作脓毒症动物模型，分别在不同的作用时间点监测大鼠心脏功能及组织结构的改变以及心肌组织中β3整合素的变化，结果发现在脓毒症发生早期大鼠即发生心功能的变化，而心脏组织结构形态的变化则出现较晚，通过Western blot及IHC发现心肌组织中β3整合素的改变主要发生在LPS注射6h之后的实验组，说明β3整合素的改变与心脏组织结构的变化存在密切关系。
目前脓毒症心肌损伤的机制尚不明确，认为主要包括以下几个方面：细胞因子对心肌的损伤（TNF_α、IL_1β、IL_6）；一氧化氮的影响；缺血-再灌注和氧自由基损伤；心肌细胞内Ca2+稳态失衡；能量代谢异常；心肌局部肾素-血管紧张素RAS系统的过度激活等，而近年来心肌凋亡途径参与脓毒症心肌损伤的机制也受到重视[5]。
本文应用Western blot和免疫组化检测脓毒症大鼠心肌组织中β3整合素的表达变化，结果显示心肌组织中β3整合素在LPS作用6h后与对照组相比较表现为显著性的下降（灰度值比较P<001），推测β3整合素在脓毒症心肌损伤中发生了显著改变，分析其可能与心肌细胞内Ca2+稳态显著性改变、细胞凋亡、血小板活化等因素相关。
心肌细胞内Ca2+稳态显著性改变是脓毒症心肌损伤的重要机制之一，研究表明细胞内Ca2+超载在心肌缺血-再灌注损伤发病机制中起中心作用[6]。整合素受体中的αIIbβ3、αvβ6、αvβ5、α5β1 及α5β3都曾被发现与Ca2+电流信号有关，它们可以介导细胞与纤维连接蛋白之间的连接，短暂激活p42/p44 MARK通路，增加心肌细胞内的钙离子浓度[7]。此外有研究发现用β3整合素基因敲除的老鼠中研究证明β3整合素介导Pyk2途径在导致心脏纤维化中起到关键作用[8]。在本研究脓毒症心肌损伤中，整合素受体与钙离子浓度相关的β3整合素的表达异常，说明其可能参与心肌细胞内钙离子浓度失衡机制，使心肌收缩和舒张功能受到抑制，最终导致心力衰竭。
在脓毒症心肌损伤的机制中两条细胞凋亡途径已经被确认：第一是肿瘤坏死因子受体（TRADD）相关激活第一途径（外源性凋亡级联）；第二个途径由外源应力引起的刺激激活的凋亡机制。在多种动物模型中观察到αvβ3抑制剂可通过激活半胱天冬酶8（Caspase 8）依赖凋亡通路及增强肿瘤抑制因子p56活性、降低抗凋亡蛋白Bax水平，诱导内皮细胞发生凋亡，从而抑制血管、肿瘤生长[9]。在本研究中发现β3整合素在脓毒症晚期表达显著性下降，分析其可能促使细胞凋亡机制紊乱，激活相关凋亡途径，使心肌病理凋亡过程加速，从而导致脓毒症心肌损伤后心力衰竭的发生。
另外，整合素αIIbβ3主要表达于巨核细胞和血小板表面，是血小板膜的主要受体，并且它的活化被视作血小板活化及血栓形成的最终共同通路。当整合素αIIbβ3表达异常或缺陷时，可能导致心肌组织间的瘀血现象，进一步造成心肌组织病理形态学和功能学的改变[10]。最近研究发现心肌组织中β3整合素缺失会增加毛细血管通透性和组织液的渗漏，导致心肌组织的损伤[11]。
本文表明脓毒症大鼠心肌组织中β3整合素表达显著性下降，但其具体机制需进一步研究。
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（收稿日期：2015_3_10）