异常血流动力对TLR4/NF—κB信号传导通路及其下游炎症因子的影响

朱晔斌+朱晔君+李淑珍

[摘 要] 目的 研究异常血流应力或压力单独作用对人脐静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）Toll样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）/NF-κB信号传导通路及下游炎症因子：血凝素样氧化低密度脂蛋白受体-1（lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1，LOX-1）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、细胞间粘附分子-1（ICAM-1）及血管细胞粘附分子-1（VCAM-1）等的影响，探讨异常血流动力导致动脉粥样硬化的机制。方法 将生长良好的HUVECs以1×105个/ml密度接种于细胞综合应力刺激实验系统（型号BIO-CCS13）中进行干预。将HUVECs按所受的应力不同分成应力组、压力组和正常组。在各组应力作用下培养一天后收集细胞备用，用qPCR方法测定TLR4、髓样分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）、肿瘤坏死因子受体相关因子-6（tumor necrosis factor receptor-associated factor-6，TRAF-6）、血凝素样氧化低密度酯蛋白受体-1（LOX-1）、核因子-κB（NF-κB）、TNF-α、ICAM-1及VCAM-1因子的基因表达，用蛋白质印迹方法测定TLR4、NF-κB、LOX-1、TNF-α、ICAM-1及VCAM-1因子的蛋白表达。结果 与正常组比较，应力组和压力组TLR4、MyD88、TRAF-6、LOX-1、NF-κB、TNF-α、ICAM-1及VCAM-1mRNA表达水平显著升高（P<0.01），TLR4、LOX-1、NF-κB、TNF-α、ICAM-1及VCAM-1蛋白表达显著升高，差异有统计学意义（P<0.01）。结论 异常血流动力导致动脉粥样硬化的机制可能与激活TLR4/NF-κB信号传导通路和增强下游炎症因子：LOX-1、TNF-α、ICAM-1及VCAM-1等的表达有关。

[关键词] Toll样受体4；壁面压力；张应力；壁面切应力；动脉粥样硬化

中图分类号：R331 文献标识码：A 文章编号：1009-816X（2016）06-0415-04

[Abstract] Objective To study the effect of abnormal blood flow stress or pressure solely on expressions of Toll-like receptor 4 （TLR4）/NF-κB signaling pathway and downstream inflammatory factors in human umbilical vein endothelial cells （HUVECs）， namely lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1 （LOX-1）， tumor necrosis factor-α （TNF-α）， intercellular cell adhesion molecule-1 （ICAM-1）， vascular cell adhesion molecule-1 （VCAM-1）， as well as its possible mechanisms leading to atherosclerosis. Methods The HUVECs were divided into stress group， pressure group and normal group according to the different stresses. The 4th， 5th generation of HUVECs were inoculated in the cell synthetic stress stimulation test system （model bio-ccs13） at 1×105 cells/ml. The cells were collected respectively 24 hours after the stress of each group. The gene expressions of TLR4， myeloid differentiation factor 88 （MyD88）， tumor necrosis factor receptor-associated factor-6 （TRAF-6）， LOX-1， NF-κB， TNF-α， VCAM-1 and ICAM-1 were detected by qPCR， and the protein expressions of TLR4， NF-κB， LOX-1， TNF-α， ICAM-1 and VCAM-1 by Western blot. Results Compared with the normal group， mRNA expressions of TLR4， MyD88， TRAF-6， LOX-1， NF-κB， TNF-α， VCAM-1 and ICAM-1 increased significantly （P<0.01） in the stress group and pressure group； protein expressions of TLR4， NF-κB， LOX-1， TNF-α， VCAM-1 and ICAM-1 also increased significantly （P<0.01）. The difference was statistically significant. Conclusions The mechanism of abnormal blood flow stress or pressure leading to atherosclerosis might be associated with the activation of TLR4/NF-κB signal transduction pathway and the enhancement of its downstream inflammatory factors， such as the expressions of LOX-1， TNF-α， VCAM-1 and ICAM-1.

[Key words] Toll like receptor 4；wall pressure；circumferential strain；wall shear stress；Atherosclerosis

动脉粥样硬化（Atherosclerosis，AS）是一种常见的大中动脉发生粥样病变性疾病。它的发病机制目前多数学者认为与内皮细胞损伤、慢性炎症有密切的关系。实验研究发现Toll样受体4（Toll like receptor4，TLR4）能够促进血管内皮细胞（EC）合成与释放炎症因子，引发炎症反应。而动脉壁的多种细胞都能表达Toll样受体（TLRs）如：内皮细胞、巨噬细胞及平滑肌细胞等，这些细胞的TLR4被激活后可引发炎症反应。在内皮细胞损伤、慢性炎症导致AS的发病机制中TLR4扮演着重要角色[1]。目前的研究表明：AS的发生和发展与EC的结构和功能变化有着密切的关系。EC在体内不断地受到血流动力作用。这些力可分为由血管内流体静力所产生的壁面压力（WP），由EC间的联接在血管舒缩运动过程中产生的张应力（CS），以及由血液流动所产生的壁面切应力（WSS）。适当的应力对于维持血管内皮细胞正常的生理功能必不可少，但如果应力和压力变化超过域值（如应力大，压力小或应力小，压力大），内皮细胞会发生病变，导致AS[2]。

异常血流动力能否通过激活血管内皮细胞TLR4/核因子-κB（NF-κB）信号传导通路，促进下游炎症因子的生成，来影响AS炎症反应的发展。目前，尚无这方面的相关报道[3]。本实验通过观察人脐静脉内皮细胞在应力（为切应力和张应力之和）或压力的单独作用下，对血管内皮细胞TLR4/NF-κB信号传导通路及下游的炎症因子表达的影响，从血管内皮细胞所受作用力的角度探讨AS的发病机制，为阐明异常血流动力导致AS的可能机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 细胞株：人脐静脉内皮细胞株ECV304（上海丰寿生物科技有限公司）。

1.2 试剂及仪器：人脐静脉内皮细胞完全培养基、胎牛血清购自上海素尔生物科技有限公司，PCR引物（上海生物工程技术有限公司），反转录试剂盒、qPCR试剂盒（大连宝生物工程有限公司），TLR4、NF-κB、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、血凝素样氧化低密度脂蛋白受体-1（LOX-1）、细胞间粘附分子-1（ICAM-1）及血管细胞粘附分子-1（VCAM-1）因子一抗和羊抗兔抗体（二抗）购自上海碧云天生物技术有限公司。Hema9600基因扩增仪、GSG-2000核酸/蛋白凝胶图像分析系统：珠海黑马医学仪器有限公司。细胞综合应力刺激实验系统（型号BIO-CCS13）：3Think公司。

1.3 HUVECs的培养与分组：将HUVECs株ECV-304于37℃、5%CO2的培养箱中用含10%FBS的改良型1640培养基培养传代至4～5代，将细胞以1×105个/ml接种于细胞综合应力刺激实验系统（型号BIO-CCS13）中，待细胞生长良好时随机将HUVECs按所受的应力和压力不同分成应力组、压力组和正常组，每组12孔。对应力组HUVECs施加20dyne/cm2的切应力和15%应变量的张应力。对压力组HUVECs施加12.0kPa的压应力。对正常组HUVECs施加20dyne/cm2的切应力、15%应变量的张应力和12.0kPa的压应力（接近正常生理时血管内皮细胞所受的力）[4]。应力组、压力组和正常组在各自应力的持续作用下，培养24h后收集细胞，以用于后续实验。

1.4 TLR4、髓样分化因子88（MyD88）、肿瘤坏死因子受体相关因子-6（TRAF-6）、NF-κB、TNF-α、LOX-1、ICAM-1及VCAM-1mRNA的检测：采用qPCR的方法检测其mRNA的表达。收集细胞，用Trizol提取总RNA后检测纯度和完整性，用逆转录试剂盒生成cDNA、PCR仪扩增目的基因观察结果。循环参数：95℃预变性7min，30个循环（95℃、45s，57℃、30s，72℃、40s），72℃延伸3min。PCR引物使用Primer5.0引物设计软件从Gene Bank获得，以GAPDH为内参。由上海生物工程技术有限公司合成。引物序列见表1。电泳结束后由GSG-2000核酸凝胶图像分析系统计算得出Ct值，用2-△△Ct方法计算和统计。△△Ct（实验对照组-空白对照组）=△Ct（实验对照组）-△Ct（空白对照组）。

1.5 TLR4、NF-κB、LOX-1、TNF-α、VCAM-1及ICAM-1蛋白表达检测：采用Western blot法检测目标蛋白的表达。以1×106个/ml浓度收集细胞，用含PMSF（100mM）的裂解液，于冰上裂解30min，离心取上清分装置-70℃冰箱保存备用。用BCA法测定样品蛋白浓度，以每泳道60μg样品蛋白上样，SDS-PAGE电泳后，将分离胶中样品蛋白于电转移槽中转移至硝酸纤维素膜，加适当浓度一抗，室温孵育1.5h，用TBST在脱色摇床上洗涤3次，加入辣根过氧化物酶标记的适当浓度的二抗，置室温1h后用TBST洗涤2次，进行化学发光反应、显影、定影，用凝胶图象处理系统分析目标带的净光密度值。

1.6 统计学处理：全部实验数据采用SPSS19.0版统计软件进行分析，计量资料采用（x -±s）表示，资料服从正态分布，直接采用方差分析，组间两两比较用LSD检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TLR4/NF-κB信号传导通路各因子mRNA表达水平比较：见表2。与正常组比较，应力组和压力组各因子mRNA表达显著升高，差异有统计学意义（P<0.01）。

2.2 三组中TLR4、NF-κB、LOX-1、TNF-α、VCAM-1及ICAM-1蛋白表达水平比较：见表3。与正常组比较，压力组和应力组TLR4、NF-κB、LOX-1、TNF-α、VCAM-1及ICAM-1蛋白表达水平明显升高，差异有统计学意义（P<0.01）。

3 讨论

TLRs属于I型跨膜蛋白模式识别受体，可表达于多种人类体细胞表面，HUVECs高度表达TLR4。TLRs通过跨膜信号传递作用介导先天性免疫应答和炎症反应，在细胞跨膜活化信号的转导中起着非常重要作用。TLRs通过调节先天性免疫应答和获得性免疫应答而将二者紧密联系[5，6]，TLRs中，TLR4研究的最多且与AS的发生和发展关系最密切。

进一步研究表明激活EC和平滑肌细胞膜表面的TLR4/NF-κB信号传导通路可以诱导其合成与释放大量的与AS相关的炎症因子，这些炎症因子促进AS的发生，而且在AS斑块中TLR4显著高表达[7]。与此同时，TLR4还可以介导巨噬细胞向血管内膜下迁移，同时强烈增殖平滑肌细胞[8]，进入内膜的巨噬细胞吞噬脂质后就形成了泡沫细胞，平滑肌细胞过度增殖和泡沫细胞大量堆积导致AS的形成。Hayashi等[9]研究发现，TLR4缺乏组小鼠与对照组相比其AS斑块面积明显减小。

关于TLR4的研究表明，TLR4信号传导通路包括MyD88依赖性途径和MyD88非依赖性途径，其中前者可激活NF-κB，活化后的NF-κB能够促进其下游的炎症因子（LOX-1、ICAM-1、VCAM-1及TNF-α）高表达。而这些炎症因子均可促进AS的形成[10～12]。

本实验结果表明，在正常生理条件下（正常组）血管内皮细胞同时受张应力、切应力、压力的平衡作用，TLR4这一模式识别受体在平衡力作用下不被激活，MyD88依赖性信号传导通路处于封闭状态，下游LOX-1、TNF-α、VCAM-1及ICAM-1等AS标志性炎症因子低水平表达，AS不发生。当血管内皮细胞单独受应力（为张应力和切应力之和）或压力作用时，血管内皮细胞所受应力和压力不平衡（如应力不变，压力小或应力小，压力不变），TLR4在不平衡力作用下被激活，进而激活下游MyD88依赖性信号传导通路，下游LOX-1、TNF-α、VCAM-1及ICAM-1等炎症因子高表达，促进AS的发生和发展。因此，异常血流动力因素通过激活TLR4/NF-κB信号传导通路和增强下游炎症因子的表达，导致AS，这可能是AS发生的机制之一。

参考文献

[1]Navi A， Patel H， Shaw S， et al. Therapeutic role of Toll-like receptor modification in cardiovascular dysfunction[J]. Vascul Pharmaco，2013，58（3）：231-239.

[2]Chaichana T， Sun Z， Jewkes J. Computation of hemcdynamics in the left coronary artery with variable angulations[J]. J Biomech，2011，44（10）：1869-1878.

[3]姜华，姜玉姬.益气活血复方对Toll样受体4信号转导通路及下游炎症因子的影响[J].中国中西医结合，2012，32（2）：219-223.

[4]唐植辉，汪南平.血流剪切力在动脉粥样硬化形成中的作用[J].生理科学进展，2007，38（1）：37-40.

[5]Kawai T， Akira S. Toll-like receptors and their crosstalk with other innate receptors in infection and immunity[J]. Immunity，2011，34（5）：637-650.

[6]Lin YT， Verma A， Hodgkinson CP. Toll-liike receptors and human disease： lessons form single nucleotide polymorphisms[J]. Curr Genomics，2012，13（8）：633-645.

[7]Edfeldt K， Swedenborg J， Hansson GK， et al. Expression of toll-like receptors in human atherosclerotic lesions A possible pathway for plaque activation[J]. Circulation，2002，105（10）：1158-1161.

[8]Jia SJ， Niu PP， Cong JZ， et al. TLR4 signaling：A potential therapeutic target in ischemic coronary artery disease[J]. International Immunopharmacology，2014，23（1）：54-59.

[9]Hayashi C， Papadopoulos G， Gudino CV， et al. Protective role for TLR4 signaling in atherosclerosis progression as revealed by infection with a common oral pathogen[J]. The Journal of Immunology，2012，189（7）：3681-3688.

[10]Xu S， Ogura S， Chen J， et al. LOX-1 in atherosclerosis： biological functions and pharmacological modifiers[J]. Cell Mol Life Sci，2013，70（16）：2859-2872.

[11]毛洋，刘小琼，王洪梅，等.细胞间粘附分子1、血管细胞粘附分子1促进兔动脉粥样硬化斑块内血管新生[J].中国动脉硬化杂志，2014，22（3）：217-222.

[12]郭寻竹，宋丽萍.兔动脉粥样硬化模型血清TNF-α与斑块内细胞凋亡的相关性研究[J].解放军医学院学报，2014，35（2）：174-177.

（收稿日期：2016-9-3）