蛋白酶激活受体_1在高压氧预处理诱导大鼠脑出血后脑保护中的作用

点击：0时间：2020-03-28 03:59:45

胡海涛　邱霞　熊冰

[摘要] 目的探讨蛋白酶激活受体_1（PAR_1）在高压氧预处理（HBOP）诱导的大鼠脑出血后神经保护中的作用。方法（1）SD大鼠接受连续5次HBOP或假预处理（SP），预处理结束24h后，建立基底节区脑出血模型，72h后处死，观察脑水含量，神经功能评分，TUNEL法检测血肿周围神经细胞凋亡，免疫组化方法检测血肿周围组织PAR_1的表达。（2）SD大鼠HBOP预处理前基底节区给予PAR_1激动剂（PAR_AP）或生理盐水，接受连续5次HBOP，预处理结束24h后，建立基底节区脑出血模型，72h后处死，观察脑水含量、神经功能评分，血肿周围神经细胞凋亡和PAR_1的表达。结果高压氧预处理减轻大鼠脑出血后72h血肿周围脑组织水肿[（814±08）% vs （802±06）%，P<001]，改善神经功能评分，减少血肿周围神经细胞凋亡，HBOP降低了血肿周围组织PAR_1的表达（P<005）。HBOP前给予PAR_AP激活PAR_1受体，消除了HBOP诱导的神经保护作用。结论高压氧预处理通过减轻脑组织水肿，减少神经细胞凋亡起到神经保护作用，下调PAR_1的表达是可能的作用机制之一。

[关键词] 高压氧；预处理；脑出血；脑水肿；蛋白酶激活受体

中图分类号：R7433 文献标识码：A 文章编号：1009_816X（2014）02_0098_04

doi：103969/jissn1009_816x20140204Effects of Protease_activated Receptor_1（PAR_1） on Brain Tolerance after Experimental Intracerebral Hemorrhage Induced by Hyperbaric Oxygen Preconditioning HU Hai_tao， QIU Xia， XIONG Bing Department of Neurology， The Second Affiliated Hospital of Zhejiang Medical College， Zhejiang 310009， China

[Abstract] Objective To investigate the effects of protease_activated receptor_1（PAR_1） on brain tolerance after experimental intracerebral hemorrhage induced by hyperbaric oxygen preconditioning Methods This study had two experimental groups Group 1， Sprague_Dawley rats received five consecutive sessions of hyperbaric oxygen preconditioning （HBOP） or sham preconditioning （SP） Twenty_four hours after preconditioning， rats received an infusion of autologous blood into the caudate They were killed 72 hours later ，and brain water content， neurological function， neuronal cell apoptosis and PAR_1 expression were measured Group 2， rats received an intracaudate injection of PAR_1 agonist peptide （PAR_AP） or normal saline before HBOP， then they received five consecutive sessions of HOBP Twenty_four hours after HOBP， rats received an intracaudate blood infusion Brain water content， neurological function， neuronal cell apoptosis and PAR_1 expression were measured 72 hours after the rats were killed Results HOBP reduced perihematomal edema 72 hours after ICH （（814±08）% vs （802±06）%，P<001）， reduced neurological deficits and decreased perihematoma neuronal cell apoptosis and improved PAR_1 expression（P<005） Intracaudate infusion of PAR_AP activated PAR_1 expression and abolished HBOP induced neuro_protection Conclusions HOBP attenuates brain edema formation， neuronal cell apoptosis and neurological deficits after ICH Inhibition of PAR_1 contributes to that effects

[Key words] Hyperbaric oxygen； Preconditioning； Intracerebral hemorrhage； Brain edema； Protease_activated protein_1

高压氧预处理（HBOP）诱导的“脑缺血耐受”现象在很多动物实验中被证实[1，2]。Qin[3]等研究发现，连续5天HBOP能显著减轻SD大鼠脑出血24h后脑水肿，诱导脑出血后“脑损伤耐受”，但作用机制尚不明确。脑出血后血肿释放的凝血酶是诱导脑组织损伤过程的关键因子之一，与神经细胞凋亡、脑组织水肿密切相关。高浓度的凝血酶主要通过结合蛋白酶激活受体_1（PAR_1），激活RhoA、蛋白激酶C（PKC）和丝裂原激活的蛋白激酶（MAPK）等通路产生神经毒性作用[4]，凝血酶抑制剂能降低其毒性作用。以往的体外研究也发现，凝血酶预处理诱导的神经元保护作用是通过PAR_1介导的，PAR_1激动剂可以模拟凝血酶预处理的作用[5]。本文通过观察HBOP以及PAR_1激动剂（PAR_AP）对实验性大鼠脑出血后脑水肿，神经功能评分以及血肿周围神经细胞凋亡的影响，探讨PAR_1在HBOP诱导脑出血后脑保护中的作用。

1 资料与方法

11 动物及分组：选用雄性Spradgue_Dawley大鼠48只，体重300～350g，由浙江省医学科学院动物实验中心提供。本实验分为2个部分：（1）将大鼠随机分为高压氧预处理（HBOP）组（n=12）和假预处理（SP）组（n=12）。最后一次预处理结束24h后，立体定向基底节内注射大鼠自体股动脉血100μL建立基底节脑出血模型。模型建立72h后，进行大鼠神经功能评分，将其中12只大鼠（HBOP组和SP组各6只）断头取脑，采用干湿重法测定脑组织水含量；另外12只大鼠（HBOP组和SP组各6只）处死，取脑组织切片；（2）将24只大鼠分为PAR_1激动剂（PAR_AP）组（n=12）和溶剂对照（Vehicle）组（n=12），其中PAR_AP组在预处理前1h，右侧尾状核内给予PAR_AP（5μl，10nmol，美国Anaspec公司），溶剂对照组给予生理盐水5μl。预处理结束后24h，制备大鼠脑出血模型，模型建立72h后，评价大鼠神经功能，测定脑组织水含量、神经细胞凋亡和PAR_1的表达。

12 方法：

121 高压氧预处理：HBOP组大鼠置入动物实验用高压氧舱内，以医用纯氧作气源，15min内匀速加压至3个绝对大气压（1个绝对大气压≈100kPa）。通过调整进出口气流量维持氧舱内压力平稳，并维持舱内氧浓度99%以上，持续1小时后于30分内均匀降压至1个绝对大气压，1次/天，连续5天。SP组大鼠也置入高压氧舱内，只暴露于1个绝对大气压的空气中，1次/天，连续5天。

122 大鼠基底节脑出血模型的建立：大鼠最后一次预处理结束24h后，腹腔内注射戊巴比妥麻醉（40mg/kg），右侧股动脉插管，取血约03ml，立体定位仪（Kopf Instruments，Tujunga，CA）下右侧尾状核注射非肝素化自体血100μl（坐标：囟门前02mm，向右40mm，腹侧进针55mm），微泵以1μl/min的速度注入，注毕停留2min后缓慢退针。术中无菌操作，保持体温在375℃，并监测平均动脉压、血气分析、红细胞压积和血糖等，术后自由进食、进水。

123 神经功能评分：在大鼠术前和术后72h，采用Hua[6]等的大鼠转角试验和前肢放置试验来判断神经功能缺损的程度。转角试验：将大鼠放在角度为30°的夹角内，观察其转身出角的转向，向左或向右，连续10次，每次间隔时间不小于15秒，神经功能得分=（右转次数/总次数）×100%。大鼠前肢放置试验：大鼠前爪悬空，每次试验用一侧胡须轻触桌面，正常反应为大鼠前肢即刻抓向桌面，记1分，共10次，记录前肢正确放置次数的百分比。

124 脑组织水含量：大鼠脑出血模型制作72h后，腹腔注射1%戊巴比妥钠深麻醉（60mg/kg），快速断头完整取出脑组织，以皮层穿刺点为中心作一冠状位断层（层厚约3mm），该断层脑组织再沿中线分离为右侧皮层、右侧基底节、左侧皮层、左侧基底节，另取小脑作为参照。然后将标本在100℃下烘干24h再进行称量干质量。脑组织水含量（%）=（湿质量-干质量）/湿质量×100%。

125 TUNEL染色和免疫组化染色：大鼠在相应时间点予戊巴比妥过量麻醉（60mg/kg），含4%多聚甲醛的01mol/L PBS液（pH 74）心内灌注，至大鼠四肢变硬、发白，断头完整取出脑组织，4℃下在上述固定液中继续固定4～6h后，转移至30%蔗糖中脱水3～4d，待脑组织沉到底部，用OCT包埋剂包埋后进行冰冻切片，厚度为18μm。取切片行TUNEL法免疫组化染色，镜下观察血肿周围神经细胞凋亡情况（方法按TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒说明书进行）。PAR_1的染色步骤：切片室温干燥5min，放入03%Tritonl00的01mol/L PBS液浸泡15min，用10%的正常山羊血清孵育30min。加入兔抗鼠单克隆PAR_1（浓度1：500，Cell signaling公司），4℃过夜。添加辣根过氧化酶标记的羊抗兔IgG，室温孵育90min。以上每完成一步骤后均用PBS液漂洗3次×5min/次。DAB显色2～5min，封片，400倍光学显微镜下观察。随机选取切片上5个不同的血肿周围组织，计算阳性细胞数，取平均值。

13 统计学处理：采用SPSS160版统计软件包，结果用（x -±s）表示，采用成组设计资料的t检验和单因素方差分析，P<005为差异有统计学意义。

2 结果

21 实验大鼠的生理参数比较：本研究各组大鼠的平均动脉压、血气分析、红细胞压积、血糖等各项生理指标变量，均在正常范围，各组间差异无统计学意义（P>005）。

22 HBOP对大鼠脑出血72小时后神经功能评分及脑水含量的影响：大鼠脑出血72小时后，HBOP组大鼠神经功能评分与SP组相比显著改善，差异有统计学意义（P<001），见表2。HBOP组大鼠血肿侧基底节水含量显著低于对照组（P<001），其他部位脑组织水含量组间差异无统计学意义，见表3。

23 HBOP减少大鼠脑出血72小时后血肿周围脑组织细胞凋亡和PAR_1的表达：TUNEL法染色中典型细胞凋亡形态特征为胞体缩小，胞核浓染成棕色或棕黑色。本实验显示，大鼠脑出血后72小时，HBOP组大鼠血肿周围脑组织TUNEL阳性细胞数少于SP组[（1057±312）/mm2 vs （1886±244）/mm2，P<001]。免疫组化分析显示脑出血周围脑组织PAR_1表达阳性的细胞数，HBOP组显著少于SP组[（1583±267）/mm2 vs （2944±346）/mm2，P<001]。

24 PAR_AP对HBOP后出血周围脑组织PAR_1的表达，神经细胞凋亡、脑水含量以及神经功能的影响：HBOP前脑内给予PAR_AP显著增加了HBOP大鼠脑出血72小时后血肿周围脑组织PAR_1表达阳性细胞数[（2367±422）/mm2 vs （1713±337）/mm2，P<001]以及血肿周围凋亡的神经细胞[（1638±283）/mm2 vs （1175±291）/mm2，P<001]。PAR_AP增加了HBOP大鼠脑出血72小时后出血侧基底节区脑水含量[（810±03） vs （805±04），P<005]。PAR_AP使HBOP大鼠脑出血72h后神经功能也明显恶化，见表4。

3 讨论

1996年Wada[1]首次发现重复HBOP能显著减轻沙土鼠海马区神经组织缺血后细胞损伤，这种现象称为“脑缺血耐受”，此后多位学者发现HBOP在肝脏、脊髓、心脏等器官均能诱导该现象[7，8]。Qin[3]等研究发现，HBOP能减轻大鼠脑出血后24h脑水肿，减少血肿周围神经细胞凋亡起到神经保护作用。既往实验研究表明大鼠脑出血后脑内水肿高峰期在出血后3～4天，脑组织损伤也最严重[9]。我们的研究结果发现HBOP显著减轻大鼠脑出血72h时的脑水肿，血肿周围的神经细胞凋亡与假预处理组比较也有下降，同时神经功能显著改善，提示HBOP减轻脑出血后脑水肿和神经细胞凋亡有一定的持续性。

脑出血后血液在凝固过程中产生的大量凝血酶具有细胞毒性作用，是出血后一系列病理生理变化而致继发性脑损伤的关键物质[10]，凝血酶特异性抑制剂-水蛭素可以抑制PAR_1的表达，减轻神经细胞损伤。凝血酶受体是一种蛋白酶激活受体（PAR），PAR_1在脑内分布最广泛，脑出血后PAR_1在凝血酶介导的神经细胞损伤中起主要作用。脑出血后，凝血酶的产生是一个持续性的过程，姜亚军[11]等发现PAR_1的表达高峰与细胞凋亡和脑水肿的高峰一致，均在脑出血72h左右，提示PAR_1参与了脑出血后脑损伤的全过程。以往我们的体外研究也发现，凝血酶预处理诱导的神经元保护作用是通过PAR_1介导的，PAR_1激动剂可以模拟凝血酶预处理的作用[5]。PAR_1活化后激活细胞内多个信号传导通路，如激活RhoA、蛋白激酶C、丝裂原激活的蛋白激酶（MAPK），激活核内蛋白合成酶的表达，促进细胞凋亡蛋白的表达和释放，加重脑水肿和继发性脑损伤[4，12]。Gingrich[13]等的研究发现PAR_1介导的神经细胞损伤机制也可能涉及NMDA受体作用。本实验的研究结果发现，HBOP可以降低脑出血后血肿周围神经细胞PAR_1的表达，预处理前尾状核内给予PAR_1激动剂，增加了血肿周围神经细胞PAR_1的表达，抑制了HBOP诱导的减轻脑出血后脑水肿、减少神经细胞凋亡和改善神经功能损害的神经保护作用。这些结果提示了PAR_1水平的下调在HBOP诱导的脑保护作用中起到重要作用，是可能的机制之一。

综上所述，HBOP可能通过下调PAR_1的表达，降低细胞凋亡相关信号通路的激活，减少血肿周围的神经细胞凋亡，从而起到减轻脑出血后脑水肿和改善神经功能的作用。

参考文献

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