AQP4与PKC在大鼠CIR后脑水肿模型中的变化及作用
刘新亚等
[摘要]目的通过研究大鼠局灶性脑缺血再灌注后水通道蛋白4（AQP4）、蛋白激酶C（PKC）表达水平的变化，来探讨两者与脑水肿之间的关系。方法通过线栓法复制大鼠大脑中动脉缺血（MCAO）再灌注模型，动物随机分为正常对照组（Norm）、假手术组（Sham）、缺血再灌注组（CIR）。参照Garcia JH法进行神经功能缺损评分、用Elliot法检测脑组织含水量、免疫组化法检测AQP4及PKC的表达。结果CIR后6h即有神经功能缺损，脑含水量在CIR12h明显升高，1～3d时达到高峰；AQP4表达在早期水平降低，从12h逐渐升高，至CIR 24h明显升高，3d达高峰；PKC在CIR后6h开始持续性升高，至第5d仍保持较高水平。结论早期的细胞源性脑水肿可能和PKC的升高有关，后期的血管源性脑水肿可能和AQP4的升高相关。
[关键词]水通道蛋白4；蛋白激酶C；脑水肿
中图分类号：R743.3文献标识码：A文章编号：1009_816X（2014）06_0456_03
[Abstract] Objective By studying the changes of expression levels of aquaporin4 （AQP4） and protein kinase C （PKC） after focal cerebral ischemia_reperfusion in rats to investigate the relation among AQP4， PKC and brain edema. Methods The model of middle cerebral artery （MCA） of rats was duplicated by using the suture method. The rats were randomly divided into normal control group （Norm）， sham_operation group （Sham）， cerebral ischemia reperfusion group （CIR）. Scores of neurofunctional defect were graded according to Garcia JH method， Elliot method was used to measure water content in brain tissue， the expression of AQP4 and PKC in brain tissue was observed by immunohistochemistry. Results After cerebral ischemia_reperfusion （CIR）， Neurofunctional defect occurred after 6h. Water content in brain tissue increased after CIR 12h， which was up to highest point after 1_3days. The expression levels of AQP4 decreased in early， then the levels increased gradually since 12h later， obviously increased CIR24 h， and to highest point after 3 days. While PKC increased gradually after CIR6h， and kept high level for 5 days. Conclusions Early Cell_derived brain edema may relate to the rise of PKC； upper vasogenic brain edema may be related to the rise of AQP4.
[Key words] Aquaporin4 （AQP4）； Protein Kinase C （PKC）； Brain edema
水通道蛋白4（aquaporin4，AQP4）与脑水肿关系密切[1]，AQP4是分布在脑组织中主要与水通透有关的水通道蛋白，具有选择性的水转运功能。目前对AQP4在水分子转运及水平衡调节过程中具体作用机制越来越被众多学者关注：AQP4参与了脑缺血再灌注（cerebral ischemic reperfusion，CIR）后脑水肿的形成[2]。研究发现AQP4的作用机制与G蛋白有关，而蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）是G蛋白信号通路的中心分子之一，PKC或PKC的激活剂可以抑制AQP4的表达[3]；但也有实验证明，在脑损伤后，PKC表达水平升高，促使兴奋性氨基酸、自由基等的释放，加重神经元缺血性损害，直接参与并加重了脑水肿的形成[4]。为此，我们以大鼠大脑中动脉缺血（MCAO）再灌注模型为研究对象，研究AQP4、PKC在不同时相上的动态变化与脑水肿的关系，来阐明两者在脑水肿中的作用和相互关系。
1材料与方法
1.1试验动物及分组：由南京青龙山实验动物养殖中心提供，健康雄性SD大鼠72只，鼠龄3～4个月，体重在280～330g，等级：cl，术中、术后死亡或神经功能评分未达要求者由备用组补充，具体分组见表1。
1.3方法：线栓法制作大鼠大脑中动脉阻塞缺血再灌注（MCAO/R）模型，缺血2h后，恢复再灌注，假手术组行相同手术，但置入线栓深度小于10mm。参照Garcia JH[5]的方法对所有实验大鼠进行神经功能评分，最高评分为18分、最低为3分；采用Elliot公式计算脑组织含水量，脑组织含水量=（湿重-干重）/湿重×100%；采用SABC法行免疫组织化学染色，结果判定依据染色强度和阳性目标的数量不同进行评分，评分分为0～7、共8个等级。
1.4统计学处理：应用SPSS17.0版统计软件进行统计学处理，实验数据以（x-±s）表示，多组均数间的比较采用单因素方差分析，方差不齐时，用Tamhane's T2检验。均数间的两两比较采用q检验，双变量关系采用直线相关分析，显著性水准均为α=0.05，P<0.05为差异有统计学意义。
2结果实验数据结果见表2：假手术组与正常对照组AQP4水平差异无统计学意义（P>0.05）；在CIR后6h，AQP4水平出现了降低，CIR 12h起水平逐渐升高，24h时明显升高，与正常脑组织水平的差异具有统计学意义（P<0.05）；至CIR 3d时达到峰值，至第5d虽有所下降，但仍维持在较高水平；神经功能缺损评分自CIR 6h即明显下降，脑含水量在CIR 12h改变明显（P<0.05）；而PKC在CIR 6h就已经有明显升高，持续至第5天仍保持较高水平。由此可以看出在CIR6_12h，AQP4水平尚低的情况下，水肿就已经明显发生，提示此时参与脑水肿形成的可能主要是PKC。
3讨论AQP4常表达于星形胶质细胞和室管膜细胞，尤其是与毛细血管和软脑膜接触的胶质细胞膜处，参与了脑缺血/出血、脑创伤及脑肿瘤等继发的脑水肿的形成过程，但有关实验结果及机制的观点一直存在争议。近几年的诸多实验的结果逐渐趋向认为AQP4在缺血后脑水肿中表达增多可加重脑水肿，表达减少可减轻脑水肿[6]。关于AQP4表达的调节亦不很清楚，实验发现内皮素、镁离子、黄体酮、钙离子、氯醌、丙泊酚及烟酰胺等药物可对其发挥调节作用[7，8]，但最有说服力的是蛋白激酶C（PKC），可以通过磷酸化的方式调节AQP4的活性，Harada等[9]研究了鼠CIR后PKC活性的变化，发现缺血20min再灌注早期，海马区放射活性明显增高，再灌注6～12h放射活性达最高峰，7d后放射活性下降，而且活性升高的PKC存在膜转移现象，即细胞膜的PKC活性升高，而细胞浆的活性相对下降，推测是机体的保护性应激反应，为膜的易位激活，考虑到PKC可使AQP4磷酸化而失活，此时的AQP4水平也出现了降低，更能显现出PKC对AQP4活性的抑制，使我们可以推测出其膜转移的意义在于自身调控AQP4的表达，减轻脑水肿，为机体保持最适宜的内环境。但PKC激活后可促进兴奋性氨基酸释放，加重神经元缺血性损害，可引起细胞源性脑水肿。结合本实验，PKC在CIR损伤的病理生理机制中可能扮演的角色：在CIR早期机体通过自身调节PKC表达增加，通过磷酸化的方式使AQP4失活，减轻脑水肿，是一种保护性反应，过早抑制PKC可能加重脑水肿，正如诸多学者发现，早期使用钙离子拮抗剂如尼莫地平，并不能减少AQP4表达，不能减轻脑水肿，因PKC是一种Ca2+依赖的丝氨酸蛋白激酶，随缺血再灌注时间的延长，各种损伤因子持续作用以及神经元细胞坏死，超出机体代偿范围，PKC不能有效地减少AQP4表达，AQP4增多，致血脑屏障破坏，引起严重的血管源性脑水肿，也就是早期以细胞源性脑水肿为主，后期以血管源性水肿为主，同时伴随细胞源性脑水肿。通过PKC激活剂可减少AQP4表达，但能否减轻脑水肿尚待进一步研究。
参考文献
[1]汪汇，方帆，江华.AQP4在中枢神经系统中作用的研究进展[J].中华神经医学杂志，2012，（5）：531-534.
[2]Tait MJ， Saadoun S， Bell BA， et al. Increased brain edema in AQP4_null mice in an experimental model of subarachnoid hemorrhage[J]. Neuroscience，2010，167（1）：60-67.
[3]Zhu SM， Xiong XX， Zheng YY， et al. Propofol inhibits aquaporin 4 expression through a protein kinase C_dependent pathway in an astrocyte model of cerebral ischemia/reoxygenation[J]. Anesth Analg，2009，109（5）：1493-1499.
[4]Hoshi A， Yamamoto T， Shimizu K， et al. Chemical preconditioning_induced reactive astrocytosis contributes to the reduction of post_ischemic edema through aquaporin_4 downregulation[J]. Exp Neurol，2011，227（1）：89-95.
[5]Noel G， Stevenson S， Moukhles H. A high throughput screen identifies chemical modulators of the laminin_induced clustering of dystroglycan and aquaporin_4 in primary astrocytes[J]. PLoS One，2011，6（3）：1-13.
[6]Fazzina G， Amorini AM， Marmarou CR， et al. The Protein Kinase C Activator Phorbol Myristate Acetate Decreases Brain Edema by Aquaporin 4 Down_Regulation after Middle Cerebral Artery Occlusion in the Rat [J]. J Neurotrauma，2010，27（1）：453-461.
[7]Thrane AS， Rappold PM， Fujita T， et al. Critical role of aquaporin_4（AQP4） in astrocytic Ca2+ signaling events elicited by cerebral edema[J]. Proce Natio Aca Sci，2011，108（2）：846-851.
[8]陈应柱，张娴娴，沈雪.丁基苯酞对放射性脑损伤模型大鼠皮质AQP4表达影响的观察[J].中华肿瘤防治杂志，2013，（2）：93-96.
[9]Harada K， Maekawa T， Shama KM， et al. Translocation and down_regulation of protein kinase C_alpha， _beta， and _gamma isoforms during ischemia_reperfusion in rat brain[J]. Neurochem，1999，72（6）：2556-2564.
（收稿日期：2014_6_23）
1.4统计学处理：应用SPSS17.0版统计软件进行统计学处理，实验数据以（x-±s）表示，多组均数间的比较采用单因素方差分析，方差不齐时，用Tamhane's T2检验。均数间的两两比较采用q检验，双变量关系采用直线相关分析，显著性水准均为α=0.05，P<0.05为差异有统计学意义。
2结果实验数据结果见表2：假手术组与正常对照组AQP4水平差异无统计学意义（P>0.05）；在CIR后6h，AQP4水平出现了降低，CIR 12h起水平逐渐升高，24h时明显升高，与正常脑组织水平的差异具有统计学意义（P<0.05）；至CIR 3d时达到峰值，至第5d虽有所下降，但仍维持在较高水平；神经功能缺损评分自CIR 6h即明显下降，脑含水量在CIR 12h改变明显（P<0.05）；而PKC在CIR 6h就已经有明显升高，持续至第5天仍保持较高水平。由此可以看出在CIR6_12h，AQP4水平尚低的情况下，水肿就已经明显发生，提示此时参与脑水肿形成的可能主要是PKC。
3讨论AQP4常表达于星形胶质细胞和室管膜细胞，尤其是与毛细血管和软脑膜接触的胶质细胞膜处，参与了脑缺血/出血、脑创伤及脑肿瘤等继发的脑水肿的形成过程，但有关实验结果及机制的观点一直存在争议。近几年的诸多实验的结果逐渐趋向认为AQP4在缺血后脑水肿中表达增多可加重脑水肿，表达减少可减轻脑水肿[6]。关于AQP4表达的调节亦不很清楚，实验发现内皮素、镁离子、黄体酮、钙离子、氯醌、丙泊酚及烟酰胺等药物可对其发挥调节作用[7，8]，但最有说服力的是蛋白激酶C（PKC），可以通过磷酸化的方式调节AQP4的活性，Harada等[9]研究了鼠CIR后PKC活性的变化，发现缺血20min再灌注早期，海马区放射活性明显增高，再灌注6～12h放射活性达最高峰，7d后放射活性下降，而且活性升高的PKC存在膜转移现象，即细胞膜的PKC活性升高，而细胞浆的活性相对下降，推测是机体的保护性应激反应，为膜的易位激活，考虑到PKC可使AQP4磷酸化而失活，此时的AQP4水平也出现了降低，更能显现出PKC对AQP4活性的抑制，使我们可以推测出其膜转移的意义在于自身调控AQP4的表达，减轻脑水肿，为机体保持最适宜的内环境。但PKC激活后可促进兴奋性氨基酸释放，加重神经元缺血性损害，可引起细胞源性脑水肿。结合本实验，PKC在CIR损伤的病理生理机制中可能扮演的角色：在CIR早期机体通过自身调节PKC表达增加，通过磷酸化的方式使AQP4失活，减轻脑水肿，是一种保护性反应，过早抑制PKC可能加重脑水肿，正如诸多学者发现，早期使用钙离子拮抗剂如尼莫地平，并不能减少AQP4表达，不能减轻脑水肿，因PKC是一种Ca2+依赖的丝氨酸蛋白激酶，随缺血再灌注时间的延长，各种损伤因子持续作用以及神经元细胞坏死，超出机体代偿范围，PKC不能有效地减少AQP4表达，AQP4增多，致血脑屏障破坏，引起严重的血管源性脑水肿，也就是早期以细胞源性脑水肿为主，后期以血管源性水肿为主，同时伴随细胞源性脑水肿。通过PKC激活剂可减少AQP4表达，但能否减轻脑水肿尚待进一步研究。
参考文献
[1]汪汇，方帆，江华.AQP4在中枢神经系统中作用的研究进展[J].中华神经医学杂志，2012，（5）：531-534.
[2]Tait MJ， Saadoun S， Bell BA， et al. Increased brain edema in AQP4_null mice in an experimental model of subarachnoid hemorrhage[J]. Neuroscience，2010，167（1）：60-67.
[3]Zhu SM， Xiong XX， Zheng YY， et al. Propofol inhibits aquaporin 4 expression through a protein kinase C_dependent pathway in an astrocyte model of cerebral ischemia/reoxygenation[J]. Anesth Analg，2009，109（5）：1493-1499.
[4]Hoshi A， Yamamoto T， Shimizu K， et al. Chemical preconditioning_induced reactive astrocytosis contributes to the reduction of post_ischemic edema through aquaporin_4 downregulation[J]. Exp Neurol，2011，227（1）：89-95.
[5]Noel G， Stevenson S， Moukhles H. A high throughput screen identifies chemical modulators of the laminin_induced clustering of dystroglycan and aquaporin_4 in primary astrocytes[J]. PLoS One，2011，6（3）：1-13.
[6]Fazzina G， Amorini AM， Marmarou CR， et al. The Protein Kinase C Activator Phorbol Myristate Acetate Decreases Brain Edema by Aquaporin 4 Down_Regulation after Middle Cerebral Artery Occlusion in the Rat [J]. J Neurotrauma，2010，27（1）：453-461.
[7]Thrane AS， Rappold PM， Fujita T， et al. Critical role of aquaporin_4（AQP4） in astrocytic Ca2+ signaling events elicited by cerebral edema[J]. Proce Natio Aca Sci，2011，108（2）：846-851.
[8]陈应柱，张娴娴，沈雪.丁基苯酞对放射性脑损伤模型大鼠皮质AQP4表达影响的观察[J].中华肿瘤防治杂志，2013，（2）：93-96.
[9]Harada K， Maekawa T， Shama KM， et al. Translocation and down_regulation of protein kinase C_alpha， _beta， and _gamma isoforms during ischemia_reperfusion in rat brain[J]. Neurochem，1999，72（6）：2556-2564.
（收稿日期：2014_6_23）
1.4统计学处理：应用SPSS17.0版统计软件进行统计学处理，实验数据以（x-±s）表示，多组均数间的比较采用单因素方差分析，方差不齐时，用Tamhane's T2检验。均数间的两两比较采用q检验，双变量关系采用直线相关分析，显著性水准均为α=0.05，P<0.05为差异有统计学意义。
2结果实验数据结果见表2：假手术组与正常对照组AQP4水平差异无统计学意义（P>0.05）；在CIR后6h，AQP4水平出现了降低，CIR 12h起水平逐渐升高，24h时明显升高，与正常脑组织水平的差异具有统计学意义（P<0.05）；至CIR 3d时达到峰值，至第5d虽有所下降，但仍维持在较高水平；神经功能缺损评分自CIR 6h即明显下降，脑含水量在CIR 12h改变明显（P<0.05）；而PKC在CIR 6h就已经有明显升高，持续至第5天仍保持较高水平。由此可以看出在CIR6_12h，AQP4水平尚低的情况下，水肿就已经明显发生，提示此时参与脑水肿形成的可能主要是PKC。
3讨论AQP4常表达于星形胶质细胞和室管膜细胞，尤其是与毛细血管和软脑膜接触的胶质细胞膜处，参与了脑缺血/出血、脑创伤及脑肿瘤等继发的脑水肿的形成过程，但有关实验结果及机制的观点一直存在争议。近几年的诸多实验的结果逐渐趋向认为AQP4在缺血后脑水肿中表达增多可加重脑水肿，表达减少可减轻脑水肿[6]。关于AQP4表达的调节亦不很清楚，实验发现内皮素、镁离子、黄体酮、钙离子、氯醌、丙泊酚及烟酰胺等药物可对其发挥调节作用[7，8]，但最有说服力的是蛋白激酶C（PKC），可以通过磷酸化的方式调节AQP4的活性，Harada等[9]研究了鼠CIR后PKC活性的变化，发现缺血20min再灌注早期，海马区放射活性明显增高，再灌注6～12h放射活性达最高峰，7d后放射活性下降，而且活性升高的PKC存在膜转移现象，即细胞膜的PKC活性升高，而细胞浆的活性相对下降，推测是机体的保护性应激反应，为膜的易位激活，考虑到PKC可使AQP4磷酸化而失活，此时的AQP4水平也出现了降低，更能显现出PKC对AQP4活性的抑制，使我们可以推测出其膜转移的意义在于自身调控AQP4的表达，减轻脑水肿，为机体保持最适宜的内环境。但PKC激活后可促进兴奋性氨基酸释放，加重神经元缺血性损害，可引起细胞源性脑水肿。结合本实验，PKC在CIR损伤的病理生理机制中可能扮演的角色：在CIR早期机体通过自身调节PKC表达增加，通过磷酸化的方式使AQP4失活，减轻脑水肿，是一种保护性反应，过早抑制PKC可能加重脑水肿，正如诸多学者发现，早期使用钙离子拮抗剂如尼莫地平，并不能减少AQP4表达，不能减轻脑水肿，因PKC是一种Ca2+依赖的丝氨酸蛋白激酶，随缺血再灌注时间的延长，各种损伤因子持续作用以及神经元细胞坏死，超出机体代偿范围，PKC不能有效地减少AQP4表达，AQP4增多，致血脑屏障破坏，引起严重的血管源性脑水肿，也就是早期以细胞源性脑水肿为主，后期以血管源性水肿为主，同时伴随细胞源性脑水肿。通过PKC激活剂可减少AQP4表达，但能否减轻脑水肿尚待进一步研究。
参考文献
[1]汪汇，方帆，江华.AQP4在中枢神经系统中作用的研究进展[J].中华神经医学杂志，2012，（5）：531-534.
[2]Tait MJ， Saadoun S， Bell BA， et al. Increased brain edema in AQP4_null mice in an experimental model of subarachnoid hemorrhage[J]. Neuroscience，2010，167（1）：60-67.
[3]Zhu SM， Xiong XX， Zheng YY， et al. Propofol inhibits aquaporin 4 expression through a protein kinase C_dependent pathway in an astrocyte model of cerebral ischemia/reoxygenation[J]. Anesth Analg，2009，109（5）：1493-1499.
[4]Hoshi A， Yamamoto T， Shimizu K， et al. Chemical preconditioning_induced reactive astrocytosis contributes to the reduction of post_ischemic edema through aquaporin_4 downregulation[J]. Exp Neurol，2011，227（1）：89-95.
[5]Noel G， Stevenson S， Moukhles H. A high throughput screen identifies chemical modulators of the laminin_induced clustering of dystroglycan and aquaporin_4 in primary astrocytes[J]. PLoS One，2011，6（3）：1-13.
[6]Fazzina G， Amorini AM， Marmarou CR， et al. The Protein Kinase C Activator Phorbol Myristate Acetate Decreases Brain Edema by Aquaporin 4 Down_Regulation after Middle Cerebral Artery Occlusion in the Rat [J]. J Neurotrauma，2010，27（1）：453-461.
[7]Thrane AS， Rappold PM， Fujita T， et al. Critical role of aquaporin_4（AQP4） in astrocytic Ca2+ signaling events elicited by cerebral edema[J]. Proce Natio Aca Sci，2011，108（2）：846-851.
[8]陈应柱，张娴娴，沈雪.丁基苯酞对放射性脑损伤模型大鼠皮质AQP4表达影响的观察[J].中华肿瘤防治杂志，2013，（2）：93-96.
[9]Harada K， Maekawa T， Shama KM， et al. Translocation and down_regulation of protein kinase C_alpha， _beta， and _gamma isoforms during ischemia_reperfusion in rat brain[J]. Neurochem，1999，72（6）：2556-2564.
（收稿日期：2014_6_23）